Prinsipp. Telling av leukocytter under mikroskopi i et visst antall kvadrater i tellekammeret og beregning av tall i 1 liter blod, med tanke på fortynning av blod og volumet av tellekammeret.
Reagens: 3-5% oppløsning av eddiksyre, tonet for farging kjerner av leukocytter med noen få dråper metylenblå løsning. Løsningen har en blå farge, kan lagres i lang tid.
Forutsetningen. I et tørt reagensrør løp 0,4 ml eddiksyreoppløsning. 0,02 ml blod samles opp fra en finger (du kan bruke antikoagulantstabilisert venøst blod). Tørke pipettens spiss, blås blodet fra det til bunnen av røret, bland, re-dial og blås blandingen av blod og reagens (pipettering). Merk røret og la det være til telling. Oppbevar en blanding av blod med en løsning av eddiksyre anbefales ikke mer enn 2-4 timer.
Blodet fortynnet i et reagensrør med eddiksyre, bland godt og fyll det med et teltkammer. Det fylte kammeret blir liggende i en horisontal stilling i 1 min for å slå seg ned i de hvite blodceller. Uten å endre kameraets horisontale posisjon, plasserer den den på mikroskopets bord og ved lav forstørrelse (okular 10 ×, linse 8 ×) teller de hvite blodlegemer i 100 store firkanter, noe som tilsvarer 1600 små.
For større nøyaktighet regnes leukocytter over gitteret i store firkanter, ikke delt inn i små firkanter og striper, fra det øverste venstre hjørnet av rutenettet. For bedre kontrast, mørk synsfeltet, slipp kondensatoren og lukk blenderåpningen. Cellene som ligger inne i torget og ligger på noen to linjer teller for ikke å telle den samme cellen to ganger.
Beregningen av antall leukocytter utføres i henhold til formelen:
hvor X er antall leukocytter i 1 μl blod; og - antall leukocytter i 100 store firkanter; 20 - blodfortynning; 100 er antall store firkanter; 250 er konverteringsfaktoren per 1 μl, siden volumet på ett stort torg er 1/250 μl (siden av torget er 1/5 mm, høyden er 1/10 mm).
I praksis, for å beregne antall leukocytter i 1 μl blod, blir tallet i 100 store firkanter multiplisert med 50, og i 1 liter - blir den resulterende verdien multiplisert med 106.
Merk. Når du teller leukocytter, er en feil uunngåelig i 6-8% av tilfellene.
- Med et stort antall normocytter i perifert blod teller de i antall leukocytter (både leukocytter og normocytter - kjernefysiske celler). For å riktig etablere antall leukocytter bør fra det totale antall nukleerte blodceller trekke antallet normocytter.
- De resterende feilene ligner de som oppstår ved beregning av antall røde blodlegemer i tellekammeret.
Leukocyttall
Å samle blod i leukocytmikseren til merket 0,5. Legg øyeblikkelig til blodet en fortynningsløsning av 3% eddiksyre til mark 11. Bland innholdet i kapillæren grundig og fyll på Goryaevs kammer med den. Teller utføres i minst 100 store firkanter. Disse er store, uformede linjer, som er gruppert i fire i Goryaev-kameraets rutenett. Beregn antall leukocytter i 1 l blod med formelen:
L = N x 4000 x 20 x 10 6
hvor: N er antall leukocytter i hundre store firkanter; 4000 er en multiplikator som reduserer volumet av et lite firkant til volumet av 1 μl blod; 20 - korreksjon for graden av blodfortynning; 1600 - antall leukocytter i små firkanter; 10 6 - antall mikroliter i 1 l.
Anbefalinger for registrering
Til slutt, sammenlign resultatene som er oppnådd med de normale verdiene.
Lab № 7.3
Bestemme mengden hemoglobin i blodet
194.48.155.245 © studopedia.ru er ikke forfatter av materialene som er lagt ut. Men gir mulighet for fri bruk. Er det et brudd på opphavsretten? Skriv til oss | Kontakt oss.
Deaktiver adBlock!
og oppdater siden (F5)
veldig nødvendig
Teller Hvit blodcelletall
Leukocytose kan være absolutt (sann) og relativ (omfordeling).
Absolutt leukocytose er observert ved akutte inflammatoriske prosesser, vevnekrose, akutte bakterielle infeksjoner (med unntak av tyfus, brucellose, tularemi, etc.), allergiske tilstander, ondartede svulster (med vevsødeleggelse), lukkede hodeskader og blødninger i hjernen, diabetes. uremisk koma, sjokk, akutt blodtap, som den primære reaksjonen - med strålingssykdom. En signifikant økning i antall leukocytter forekommer med leukemi.
Relativ (omfordeling) er en konsekvens av mottak av leukocytter i blodstrømmen fra organene som tjener til depotet. Det oppstår etter å ha spist (mat leukocytose), varme og kalde bad, sterke følelser (vegetovaskulær leukocytose), intenst muskulært arbeid (myogen leukocytose), etc.
Leukopeni. Leukopeni er å anse som en indikator på benmargsfunksjon undertrykkelse kapasitet på grunn av eksponering til toksiske substanser (arsen, benzen og lignende), enkelte legemidler (sulfonamider, kloramfenikol, fenylbutazon, immuran, cyklofosfamid, etc.), viruser (influensa, viral hepatitt, meslinger, etc.), mikrober (tyfus, brucellose, etc.), ioniserende stråling, røntgenstråler og hypersplenisme (økt miltfunksjon).
Leukocytose og leukopeni kjennetegnes sjelden av en proporsjonal økning (reduksjon) i totalt antall leukocytter av alle typer (for eksempel leukocytose med fortykkelse av blodet); I de fleste tilfeller er det en økning (reduksjon) av enhver celletype, men begrepene "neutrophilia" "Nøytropeni" "lymfocytose", "lymfopeni", "eosinofili", "eosinopenia", "monocytose", "monotsitopeniya", "Basophilia."
I den kliniske evalueringen av endringer i antall leukocytter er stor betydning knyttet til prosentandelforholdet mellom individuelle former for leukocytter, det vil si leukocytformel.
Leukocyt blodtal av en sunn person:
Relativ mengde Absolutt beløp
Basofiler............................0-1% 0-0.0650 x 10 9 / l
Eosinofiler.........................0,5-5% 0,02-0,30 x 10 9 / l
Neutrofiler: - myelocytter............ 0% fraværende
- stikket... 1-6% 0,040-0,300 x 10 9 / l
- segmentert....47-72% 2,0-5,5 x 10 9 / l
Lymfocytter..................................19-37% 1,2-3,0 x 10 9 / L
Monocytter.............................. 3-11% 0,09-0,6 x 10 9 / L
Leukocyttelling utføres i farget perifert blodutstryk. For riktig tolkning av resultatene av studien av leukocytformel, anbefales det å telle i absolutte mengder, men ikke i relative. De vanligste metodene for maleri utsmykninger av Romanovsky-Giemsa, Pappenheim. Under nedsenking teller minst 200 celler, og deretter blir prosentandelen av visse typer leukocytter avledet. Analyse av leukogram med hensyn til andre blodparametere og det kliniske bildet er en verdifull metode for undersøkelse, det hjelper ved diagnostisering og bestemmelse av prognosen av sykdommen.
Hovedårsakene til nøytrofili.
Akutte bakterielle infeksjoner - lokalisert og generalisert.
Betennelse eller nekrose av vevet.
Medisinske effekter (kortikosteroider).
Hovedårsakene til nøytropeni.
Infeksjoner - bakteriell (tyfus, brucellose, tularemi, paratyphoid feber) og virus (infeksiøs hepatitt, meslinger, influensa, rubella og andre).
Myelotoksiske effekter og undertrykkelse av granulocytopoiesis (ioniserende stråling, kjemiske midler - benzen, anilin, DDT, medisinske effekter - cytostatika og immunosuppressive midler, vitamin B12-folsyrebristanemi, akutt aleukemisk leukemi, aplastisk anemi).
Antistoff eksponering (immunforsvar) - Overfølsomhet overfor stoffer, autoimmune sykdommer (SLE, revmatoid artritt, kronisk lymfatisk leukemi), isoimmune manifestasjoner (hemolytisk sykdom hos nyfødte).
Omfordeling og deponering i organer - sjokkbetingelser, sykdommer med splenomegali og hypersplenisme.
Arvelige former (familiær godartet kronisk nøytropeni).
Hovedårsakene til eosinofili.
Parasittiske invasjoner (trichinose).
Kroniske hudlidelser - psoriasis, pemphigus, eksem.
Tumorer (eosinofile varianter av leukemi).
Andre sykdommer - fibroplastisk endokarditt Lefflera, skarlet feber.
I utvinningsfasen av infeksjoner og inflammatoriske sykdommer (gunstig prognostisk tegn).
Årsaker til eosinopeni (aneosinofili).
Økt adrenokortikosteroidaktivitet i kroppen.
Hovedårsakene til basofili:
Kronisk myeloid leukemi og erythremi.
Hovedårsakene til monocytose.
Subakutte og kroniske bakterielle infeksjoner.
Parasittiske infeksjoner - leishmaniasis, malaria.
Hemoblastose - monocytisk leukemi, lymfogranulomatose, lymfomer.
Andre tilstander er SLE, sarkoidose, reumatoid artritt, infeksiøs monocytose; i perioden med utvinning fra infeksjoner, når man forlater agranulocytose, etter splenektomi.
Nedgangen i antall monocytter er viktig hovedsakelig ved vurdering av lymfocyt-monocytisk forhold i lungetuberkulose.
Hovedårsakene til lymfocytose.
Infeksjoner - akutt viral (infeksiøs mononukleose, meslinger, rubella, kyllingpoks), kronisk bakteriell (tuberkulose, syfilis, brucellose), protozoal (toxoplasmose).
Hemoblastose (lymfocytisk leukemi, lymfom).
Andre sykdommer - hypertyreose, Addison sykdom, vitamin B12-folisk mangelanemi, hypo og aplastisk anemi.
Lymfocytopeni er observert i SLE, Hodgkins sykdom, utbredt tuberkulose av lymfeknuter, i den terminale fasen av nyresvikt, akutt strålingssykdom, immunodefekt tilstand, tar glukokortikoider.
Økningen eller reduksjonen i antall bestemte typer leukocytter i blodet kan være relativt eller absolutt. Hvis bare prosentandelen av en bestemt type hvite blodlegemer endres, finner sted relativ nøytrofili, relativ eosinopeni, etc.. Økningen eller reduksjonen i absolutt innhold av en hvilken som helst type leukocytter, det vil si antallet av disse cellene per volum av blod, kalles absolutt nøytrofili, absolutt eosinopeni, etc.
Bytte formelen til venstre (øke antall unge former for nøytrofiler) er et tegn på betennelse eller en nekrotisk prosess i kroppen.
Skiftet av leukocyttformelen til høyre er karakteristisk for strålingssykdom og vitamin B12-folsyre mangel anemi.
Fraværet eller signifikant reduksjon i antallet av alle typer granulære leukocytter - granulocytter (nøytrofiler, eosinofiler, basofiler) er betegnet med begrepet agranulocytose. Avhengig av forekomstsmekanismen, myelotoksiske (effekter av ioniserende stråling, cytostatisk inntak) og immun (hapten og autoimmun agranulocytose) skiller seg ut.
Leukocyttall
Tellermetoden i kameraet. Taking og fortynning av blod produsert av rørmetoden. 0,4 ml fortynningsvæske og 0,02 ml kapillærblod innføres i røret (fortrinnsvis Vidalevskaya). Den resulterende fortynning anses praktisk talt for å være 1:20. En 3-5% løsning av eddiksyre tonet med metylenblå brukes vanligvis som fortynningsmiddel (eddiksyre lyses erythrocytter, metylenblå flekker kjernene til leukocytter). Før fylling av kammeret Goryaeva rør med fortynnet blod rystes grundig. Kammeret er fylt på samme måte som for rødt blodcelletelling.
Leukocytter er mye mindre enn erytrocytter (1-2 pr. Stor firkant), derfor, for nøyaktighet, blir tallene gjort i 100 store firkanter (ungraded). Beregning: 100 store firkanter (1600 små) regnes som en leukocyt.
Husk at volumet av et lite torg er 1/4000 mm3, og blodet fortynnes 20 ganger, antall leukocytter i 1 μl blod beregnes: 4000 20 og delt med 1600 = a x 1/2. For å oppnå det virkelige innholdet av leukocytter i 1 μl blod, er det tilstrekkelig å dele i halvparten av tallet som er oppnådd i beregningen, og legge til 2 nuller. Den gjennomsnittlige metoden feil er ± 7%.
Mer nøyaktig (2-3% feil) og perfekt er tellingen av leukocytter ved hjelp av elektroniske enheter. Telling av leukocytter i partikkel tellere utføres i henhold til samme prinsipp som erytrocytter. Forblod er fortynnet og blandet med noen reagenslysering av røde blodlegemer. Den autoanalysator "Technion" som sådan anvendes eddiksyre, i apparaturen "Coulter" og "Tselloskop" - saponin eller sapoglobin som legger fortynnet (1: 500, 1: 700) i isotonisk natriumklorid-løsning (6 dråper pr 20 ml fortynning).
Blodleukocyttelling utføres i farget perifer blodutstryk.
Det er bedre å telle på det tynneste punktet nær smørets ende, minst 200 celler (unntatt uttalt leukopeni), og deretter utlede prosentandelen av visse typer hvite blodlegemer. Telling er anbefalt i den samme rekkefølgen: halvparten av celletallet i den øvre halvdel - ved bunnen av slaget, uten å gå til kanten og midten av sikksakk (3-4 syn langs smøre, 3-4 felt vinkelrett inn mot midten av slaget, så 3-4 felt til siden parallelt med kanten, igjen vinkelrett oppover og så videre til den ene siden).
Utarbeidelse av smører. Nøye vasket og avfettet glass (kanten) berører en dråpe blod på injeksjonsstedet. Smøre gjør slipeskjerm, legg det i en vinkel på 45 ° til lysbildet foran dråpen. Etter å ha tatt glasset til denne dråpen, venter de til blodet sprer seg langs kanten, og med en rask, enkel bevegelse utfører de slipeglasset fremover, ikke tar det bort fra motivet før det tørker hele dråpen.
Et skikkelig smurt har en gulaktig farge (tynn), når ikke glassets kanter og slutter i et spor (bart).
Fargestørrelser fremstilt etter foreløpig fiksering. Den beste fikseringen oppnås i absolutt metylenalkohol (3-5 minutter) eller i en blanding av Nikiforov med like deler av absolutt etanol og eter (30 minutter).
De viktigste hematologiske malingene inkluderer metylenblå og dets derivat - azurblå I (metylen azurblå) og azurblå II (en blanding av like deler azurblå I og metylenblå), til surt - vannoppløselig gul eosin.
● Maleri av Romanovsky-Giemsa. Romanovsky-Giemsa-maling (fabrikk-laget) har følgende sammensetning: Azur II - 3 g, vannløselig gul eosin - 0,8 g, metylalkohol - 250 ml og glyserin - 250 ml. Arbeidsmalingløsningen fremstilles ved en hastighet på 1,5-2 dråper ferdig maling per 1 ml destillert vann. Malingen helles på et smør med et muligens høyere lag; fargetid - 30-35 minutter Etter denne perioden vaskes vattpinnen med vann og tørkes i luft. I denne metoden er det mulig å differensiere kjernen godt, men cytoplasmens neutrofile granularitet er mye verre, så det er mye brukt til å fargelegge et perifer blodsprøyt.
● Kombinert May-Grunwald-Romanovsky-Giemsa-fargestoff ifølge Pappenheim. Et ferdig fargestoff, et mai-Grunwald-fiksativ, som er en løsning av eosinmetylenblå i metylenalkohol, pipetteres på et fast smear i 3 minutter. Etter 3 minutter tilsettes en lik mengde destillert vann til malingen som dekker oppløsningen, og fargen fortsetter i ytterligere 1 minutt. Etter det blir maling vasket av og smeten tørkes i luften. Deretter blir det tørkede smearet malt med en nytilberedt vandig løsning av Romanovsky-maling i 8-15 minutter. Denne metoden regnes som den beste, spesielt for smører av marrow punctates.
En økning i antall leukocytter i det perifere blod over det normale nivå kalles leukocytose, en reduksjon kalles leukopeni. Leukocytose (leukopeni) kjennetegnes sjelden av en proporsjonal økning (reduksjon) i antall leukocytter av alle slag, for eksempel leukocytose med fortykning av blodet. I de fleste tilfeller er det en økning i antall (reduksjon) av en hvilken som helst celletype. Økningen eller reduksjonen i antall individuelle typer leukocytter i blodet kan være relativt eller absolutt, avhengig av totalt leukocyttall - normalt, forhøyet eller redusert. Endringen i antall, forholdet mellom individuelle former og morfologi av leukocytter avhenger av patogenens type og virulens, naturen, kurset og omfanget av den patologiske prosessen, den individuelle reaksjonen av organismen.
Leukocytter (leukocytter)
Leukocytter. Kvantitativ bestemmelse av leukocytter. Telle leukocytter ved hjelp av kameraet Goryaeva. Kvantitativt innhold av leukocytter. Leukocytose.
Hvite blodlegemer
Antall leukocytter i blod avhenger av hastigheten av deres dannelse og deres mobilisering fra benmargen, så vel som utvinning og migrering inn i vev (skade foci), å fange opp lys og milt. Disse prosessene i sin tur påvirkes av en rekke fysiologiske faktorer, og derfor antallet av leukocytter i blod fra en frisk person er utsatt for svingninger: det stiger mot slutten av dagen, under fysisk anstrengelse, emosjonelt stress, mottak proteinrik mat, en skarp endring i omgivelsestemperaturen.
Kvantitativ bestemmelse av leukocytter
Leukocytter teller ved hjelp av Goryaev-kameraet og bruker automatiske tellere.
Telle leukocytter ved hjelp av kameraet Goryaeva
Med in vitro-metoden for å ta blod for å telle leukocytter:
- 0,4 ml av en oppløsning av 3-5% eddiksyre tonet med metylenblått helles i røret. Bruk en kapillærpipette til å tegne 20 μl blod fra en frisk dråpe (fortynning 20 ganger), skru den forsiktig inn i et reagensrør med et reagens og skyll pipetten. Bland godt
- et rent og tørt dekselglass gnides på kammeret slik at regnbuens ringer danner ved kontaktpunktet;
- Blod fortynnet i et reagensrør, bland godt. Enden av en rund glassstang tar en dråpe blod og bringer den til kanten av kammerets polerte glass;
- Etter fylling av kammeret blir det igjen i 1 min i ro for sedimentering av leukocytter;
- Leukocytter vurderes ved lav forstørrelse (objektiv × 8 eller × 9, okular × 10 eller × 15) med mørkret synsfelt (med nedsenket kondensator eller innsnevret membran);
- For tilfredsstillende resultater teller leukocytter i 100 store firkanter.
Å vite volumet av et stort torg og graden av fortynning av blod, finner antall leukocytter i 1 μl og 1 1 blod. Siden av det store torget er 1/5 mm, området er 1/25 mm2, volumet av plass over dette torget er 1/250 mm3.
Formel for å telle hvite blodlegemer:
hvor B er antall leukocytter i 100 store firkanter;
P - grad av fortynning (20).
Leukocyttall
Norm: 4,0-9,0 × 10 9 / L
Økningen i antall leukocytter over 9,0 × 10 9 / l kalles
leukocytose, en nedgang i antallet under 4,0 × 10 9 / l - leukopeni. Imidlertid kan selv 3,5 × 10 9 i 1 liter leukocytter for en rekke individer være normen. Ifølge litteraturen har slike personer økt immunmotstand og de er mindre sannsynlige å bli syke, noe som synes å skyldes behovet for et immunrespons å ha en reserve av leukocytter i vev, hvor det er 50-60 ganger mer enn i blodet. Åpenbart, hos friske personer med lave hvite blodlegemer i perifert blod, øker deres reserver i vev tilsvarende. Dette fenomenet forklares av arvelig og familiær karakter eller ved en økning i påvirkning av det parasympatiske nervesystemet.
Leukopeni kan være funksjonell og organisk.
Funksjonell leukopeni er assosiert med dysregulering av bloddannelse og observeres:
- med enkelte bakterielle og virusinfeksjoner (tyfusfeber, influensa, kopper, røde hunder, Botkin's sykdom, meslinger);
- under virkningen av stoffer (sulfonamider, analgetika, antikonvulsiva midler, antithyroid, cytostatiske og andre legemidler);
- under muskelarbeid, innføring av fremmed protein, nerve og temperatureffekter, sult, hypotoniske tilstander;
- falsk leukocytopeni kan være assosiert med leukocytt aggregering ved langvarig lagring av blod ved romtemperatur (mer enn 4 timer).
Organisk leukopeni som følge av benmarg aplasi og erstatning med fettvev, oppstår når:
- aplastisk anemi
- agranulocytose;
- leukopenisk leukemi;
- noen former for Hodgkin's sykdom;
- ioniserende stråling;
- hypersplenisme (primær og sekundær);
- kollagen sykdommer.
leukocytose
Leukocytose er reaksjonen av det hematopoietiske systemet til effektene
eksogene og endogene faktorer. Det er fysiologisk og patologisk leukocytose.
Fysiologisk leukocytose er:
- fordøyelsessystemet - etter å ha spist, spesielt høyt i protein; antall leukocytter overstiger ikke 10,0-12,0 × 10 9 / l og etter 3-4 timer vender det tilbake til normalt;
- i henhold emosjonelt stress (avgivende epinefrin), tung fysisk belastning, kjøling, dreven soling (solbrenthet), innføring av en rekke hormoner (katekolaminer, glukokortikoider og al.), i den andre halvdel av graviditet og i løpet av menstruasjonen og som skyldes ujevn fordeling av leukocytter i blod den vanlige.
Patologisk leukocytose er delt inn i absolutt og relativt.
Absolutt leukocytose - en økning i antall leukocytter i blodet opptil flere hundre tusen (100,0-600,0 × 10 9 / l og mer).
- Mest sett i leukemi: i kronisk leukemi - i 98-100% av tilfellene, ved akutt leukemi - i 50-60%. Endring av forholdet mellom leukocyttceller i beinmarg og blodpunkta tjener som grunnlag for diagnosen leukemi.
Relativ leukocytose er observert:
- akutt betennelses- og smittsomme prosesser, med unntak av tyfusfeber, influensa, kopper, rubella, Botkin's sykdom, meslinger. Den største leukocytose (opptil 70,0-80,0 × 10 9 / l) observeres i sepsis;
- under påvirkning av giftige stoffer (insektgift, endotoksiner), ioniserende stråling (umiddelbart etter bestråling);
- som et resultat av virkningen av kortikosteroider, adrenalin, histamin, acetylkolin og digitalispreparater;
- med vevsoppløsning (nekrose), myokardinfarkt, trombose av perifere arterier med utvikling av gangrene, brannsår, ekssudativ pleurisy, perikarditt, uremi, hepatisk koma;
- betydelig blodtap i skader, indre, gynekologisk og annen blødning.
Økningen i antall leukocytter i smittsomme sykdommer i de fleste tilfeller er ledsaget av et skifte av leukocytformelen til venstre
Telling av antall leukocytter og blodplater
Faktorer som påvirker korrektheten av studien av hvite blodlegemer
- lang lagring av blod ved romtemperatur
Norm av innholdet av leukocytter i blodet
Alder Antall leukocytter
- 1 dag 11,6 - 22,0
- 1 uke 8,1.- 14,3
- 1 måned 7,6 - 12,4
- Voksne 4,0 - 9,0
Metoder for å bestemme antall leukocytter i blodet.
- Teller antall leukocytter i tellekammeret
- Telle leukocytter i hematologiske analysatorer
Bestemme antall leukocytter i tellekammeret.
- Telling av leukocytter under et mikroskop utføres etter lysering av røde blodceller i 100 store firkanter av tellegitteret og omberegnet for 1 liter blod, basert på volumet av kvadrater og fortynning av blod. Tellingen av leukocytter bør gjøres innen 2-4 timer etter blodinnsamling.
- Hvis det er nukleerte røde blodlegemer i perifert blod, blir de ikke lysert og telt sammen med leukocytter. I dette tilfellet, for å bestemme det sanne antall leukocytter, blir antall celler i den røde raden subtrahert fra det totale antall tellte celler.
- For eksempel: Det totale antall leukocytter i beregningen i kammeret (eller analysatoren) -45x109 / l. Ved beregning av leukocytformelen ble det funnet at 50 erythroblaster (normoblaster) er tilstede per 100 leukocytter.
Vi beregner det sanne antall leukocytter i blodet:
150 celler - 45 x 109 / l
100 celler (leukocytter) - X
X = 100 * 45 * 10 / l / 150 = 30 * 10 / l
Således er det sanne antall leukocytter i blodet 30 x 109 / l.
De viktigste kildene til feil i beregningen av leukocytter i kammeret:
- Feil forhold mellom blod og eddiksyre volumer tatt i et reagensrør.
- Feil forberedt løsning av eddiksyre (i en konsentrasjon på mer enn 5%, kan noen leukocytter lyse, noe som vil føre til en undervurdering av resultatet).
- Langvarig eksponering av prøven ved temperaturer over 28 ° C, noe som kan akselerere lysen av leukocytter i prøven og føre til en underskatt av resultatet.
- Feil fylling av Goryaev-kammeret. Som med beregning av røde blodlegemer, må kameraet stå i 1 minutt for å slå seg opp i cellene.
- Goryaev-kameraet ble ikke vasket godt nok etter den forrige definisjonen. Leukocytter som er igjen i kammeret kan overvurdere resultatene av analysen.
Blodplate teller metoder
- i teltkammeret
Hver gruppe metoder har fordeler og ulemper.
- Telling av blodplater i kammeret er tilstrekkelig nøyaktig, krever ikke å beregne antall røde blodceller. På den annen side er denne metoden vanskeligere, siden blodplater i den innfødte formen er representert av små og dårlige kontrastelementer. Ulempen med metoden er blodplate telling i de kommende timene etter å ha tatt blod.
- Fastsettelse av antall blodplater i blodutløp er signifikant dårligere i nøyaktigheten av kammermetoden eller automatiske tellere. Feil ved å telle i blodutslipp kan skyldes dårlig smetekvalitet og tilhørende ujevn fordeling av blodplater, unøyaktig bestemmelse av antall røde blodlegemer. En signifikant ulempe ved fremgangsmåten er nødvendigheten av samtidig å telle blodplater og røde blodlegemer i blodet. Fordelen med det er evnen til å studere blodplater når som helst, uansett tidspunktet for blodsamlingen.
- Metoden for å bestemme blodplater ved hjelp av en hematologisk analysator lar deg nøyaktig bestemme antallet blodplater, deres gjennomsnittlige volum og volumfordeling.
Leukocyttall
Antall leukocytter beregnes ved hjelp av en automatisk teller eller i et Goryaev-kammer. For å telle leukocytene i kammeret fremstilles en Turk væske. En eddiksyreoppløsning tonet med en vandig løsning av metylenblått (0,1 ml av en 0,1% løsning av metylenblå blir tilsatt til 9 ml 10% eddiksyre). I et reagensrør hell 0,4 ml flytende Türk. Oppnå nøyaktig 0,02 ml blod, legg forsiktig til fortynningsvæsken. Fortynning av blod er 1:20. Bland godt og la i 4 minutter. Fyll kammeret Goryaeva, etter omhyggelig risting av røret med fortynnet blod. Kameraet er igjen i 1 min på en flat overflate for sedimentering av leukocytter. Deretter telles leukocytter ved lav forstørrelse av mikroskopet (linsen 8, okularet 10 eller 15) med mørkret synsfelt (med kondensatoren senket eller den innsnevrede membranen). Leukocytter anses å være i 100 ikke-avslørte store firkanter, som tilsvarer 1600 små. Resultatene av å telle celler i store firkanter oppsummerer og beregner tallet i 1 μl blod ved hjelp av formelen:
hvor X er antall leukocytter i 1 μl blod; A - antall celler telt i 100 store firkanter, 1600 - antall små firkanter; 20 - blodfortynning; 4000 er en multiplikator som resulterer i et volum på 1 μl blod, basert på volumet av en liten firkant (1/4000 μl).
Telling av leukocytformel. Fargede perifere blodpropper undersøkes. En nødvendig betingelse for riktig vurdering av de morfologiske egenskapene til blodceller er en skikkelig gjort og godt flekket blodsmøring. Et blodsprøve fremstilles på tørre, rene, godt avfettede lysbilder, alderen i en blanding av Nikiforov (etylalkohol 96 º og dietyleter 1: 1). Ta en glidelås for lange kanter, berør overflaten til en dråpe blod (men ikke hud) som frigjøres fra punkteringen, eller bruk en bloddråpe med en mikropipett eller en kapillær. Et glassglass holdes på bordet eller i venstre hånd for smale kanter. Ved å bruke høyre hånd, bruk grunnglasset med en smal kant til glasset med blod til venstre for dråpen i en vinkel på 45 ° og skyv den til høyre til den berører blodet. De venter til blodet sprer seg over hele kanten av bakken glass, og deretter, med en rask, rask bevegelse, før den fra høyre til venstre til hele dråpen er oppbrukt. En dråpe blod skal være liten og proporsjonert slik at hele smøret settes på glasset, ikke når 1-1,5 cm før kanten. Et godt smurt er tynt, har en gulaktig farge og ender i en "kost". Lufttørkede blodsprøyter plasseres i spesielle retter til fiksering eller i vanlige glassfill fyllt med fikseringsvæske (metylalkohol, fikseringstid 3-5 minutter, etylalkohol, 30 minutter, Nikiforov-blanding, 20-30 minutter). Faste preparater tørkes i luften og farves deretter med Romanovsky-Giemsa-fargestoff. Den ferdige malingsløsningen Romanovsky-Giemsa (azureosin) fortynnet 1:10 i ønsket volum for farging. Faste smørstoffer helles med fortynnet maling, som helles på smøret med et muligens høyere lag. Coloring varer avhengig av lufttemperaturen i rommet fra 25 til 45 minutter. Etter at malingen er ferdig, må du tørke av maling med destillert vann og sette stropper vertikalt i en trestativ for tørking. Mikroskopi av blodutsprøytninger utføres med nedsenkning ved 100 × 10 forstørrelse. Telling av leukocytter utføres langs en zigzaglinje ("Meander line"). 100-200 celler regnes med hensyn til antall individuelle former for leukocytter: stab og segmenterte neutrofiler, eosinofiler, basofiler, monocytter, lymfocytter. Beregn prosentandelen av hver celletype.
Telling av absolutt antall fagocytter og lymfocytter. Det absolutte antall fagocytter (nøytrofiler og monocytter) og lymfocytter hos høyere vertebrater beregnes ut fra data på antall leukocytter i perifert blod og leukocytformel.
Fagocytisk funksjonstest
Bestemmelse av fagocytisk indeks og fagocytisk nummer
Et stort antall teknikker har blitt utviklet for å vurdere leukocytters absorpsjon og fordøyelsesaktivitet. Alle er basert på phagocytes evne til å absorbere fremmede partikler som utgjør testsystemet (en bestemt type mikroorganisme, zymosan, latex - gjenstand for absorpsjon). Åpenbaringen utføres in vitro eller in vivo. Det generelle forsøksforløpet er som følger: Heparinisert eller citrert friskt blod (eller fagocyttoppløsning) blandes med et like stort volum suspendert daglig mikrobial suspensjon (Saccharomyces cerevisiae, Staphilococcus aureus, S. albus, E. coli, A. nhydrophila) eller et annet absorpsjonsobjekt. Blandingen blandes forsiktig og plasseres i en termostat (37-40ºі - for varmblodig, avhengig av kroppens normale temperatur, 26 ° C - for varmelskende fisk og lavere for kaldt kjærlig). Etter 15, 30, 45, 60 og 90 minutter er smørefargene tilberedt på lysbilder, tørket, festet med metylalkohol eller en Nikiforov-blanding og farget i henhold til Romanovsky-Giemsa. De ser på smører under nedsenking og bestemmer fagocytisk aktivitet - andelen fagocytter som deltar i fagocytose, fagocytisk indeks - antall testmikroer fanget av en fagocytisk leukocytt, fagocytisk tall - gjennomsnittlig antall fagocytiske gjenstander per 1 aktiv nøytrofil. Evaluering av indikatorer ved forskjellige tidsintervaller gir oss mulighet til å estimere dynamikken i fagocytose. Normalt, etter 90 minutter, skal fagocytindeksen være lavere enn etter 45 minutter og 60 minutter på grunn av fordøyelsen av mikrober. Ved brudd på fordøyelsen endres det ikke.
Vurdering av den funksjonelle aktiviteten av fagocytter ved reduksjonsreaksjonen av nitroblåttetrazol (NBT-test)
Denne testen er en indikator for fagmaktens bakteriedrepende funksjon, og lar deg evaluere deres evne til oksygenavhengig drap. Når denne drapemekanismen er aktivert aktiveres enzymet NADPH-oxidase, hvilket fører til utseendet av reaktive oksygenarter i fagocyt. Utgivelsen av slike stoffer i cellen kalles en oksygen (respiratorisk) eksplosjon, som kan registreres ved hjelp av NBT-testen. I formuleringen av denne testen blir stoffet nitrosiniumtetrazolium tilsatt fagocytene, det absorberes av cellen og i nærvær av reaktive oksygenarter blir det en mørk blå farget substans, diformazan. Jo mer mørkeblå granulater er festet på overflaten eller inne i fagocytten, desto mer aktive oksygenformer dannes, jo mer oksygenavhengige drap.
NBT-testen er satt i to versjoner: spontan og indusert. Når man oppretter en spontan NBT-test, dyrkes fagocytter i nærvær av NST uten forutgående aktivering av cellene, når man utfører den induserte NBT-test, tilsettes en aktivator av fagocytisk reaksjon til dyrkningsmediet. Formulering NBT test i de to utførelsesformer tillater beregning av funksjonelle reserve-celler, som er forskjellen mellom antall (intensitet) diformazanpozitivnyh induserte celler og mengden (intensiteten) av spontane diformazanpozitivnyh celler. Verdier indusert NBT test karakterisere aktiviteten av fagocytiske celler i nærvær av antigen stimulus, og er ansett som kriterium for deres tilgjengelighet til det ferdige fagocytose. Den spontane NBT-testen tillater en å estimere graden av aktivering av oksygenavhengige drapemekanismer av ikke-aktiverte fagocytter. Det karakteriserer graden av aktivering av intracellulære mikrobicide systemer.
For fremstilling av spontan NBT-test til 0,1 ml blod ble det tilsatt 0,05 ml av en 0,2% oppløsning av HCT i kaliumfosfatbuffer (0,1 pH 7,3) og 0,05 ml av den samme buffer. Parallell for å gi en prøve for regnskapsmessig indusert NBT-test, hvor det istedenfor 0,05 ml buffer ble tilsatt det samme volum av aktivator fagocytisk reaksjon (f.eks pirogenal vkontsentratsii 50 ug / ml). Reaksjonsblandingen termosteres i et vannbad ved 37 ° C (30-60 minutter). Medium tetthetstråler fremstilles, tørkes i luft og festes i etylalkohol eller Nikiforov-blanding (20 min), deretter malt med en vandig løsning av nøytralt rødt (0,1%, 1 min)
Etter reaksjonen blir blodsprøytene mikroskopert under nedsenking (100 × linse, 10 × okular). Blant 100 celler regnes andelen aktiverte nøytrofiler (DAN,%) som inneholder diformazangranuler. I henhold til antall deponert i celler diformazan vurdere deres aktivitet i standard enheter og beregne indeksen aktivering av nøytrofile celler (IAN, standard-enheter):
hvor er Hneg. - antall celler som ikke inneholder diformazan granulat;
H1 - antall celler hvor området diformazan-innskudd er mindre enn 1/3 av arealet av kjernen;
H2 - antall celler hvor forekomster av diformazan tar fra 1/3 til hele størrelsen av kjernen;
H3 - Antall celler hvor diformazan-innskudd opptar et større område av kjernen.
Derivasjonen av mobiliseringskoeffisienten (KM) utført i henhold til følgende formel: